Actualidad Avipecuaria
Sunday, 19 November del 2017

Liliana Revolledo DVM, MSc., PhD

Universidad de Sao Paulo - Brasil



¿Cómo hacer el diagnóstico para aislar salmonella en aves?

Si las aves están tratadas no intente aislar Salmonella, ya que los resultados serán negativos, estará gastando dinero en diagnóstico inútilmente ya que no aislará nada, sin embargo, puede tener la infección persistente en su granja.

¿Cómo hacer el diagnóstico para aislar salmonella en aves? Si utiliza antibióticos, dependiendo del tipo y grupo de antimicrobiano, difícilmente aislará Salmonella en la granja, teniendo siempre resultados
Julio 11/2017
Lima - Perú
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Antes que nada: qué cosa es la salmonelosis y por qué es tan importante

En aves, existen básicamente dos tipos de infecciones por Salmonella, sistémica que afecta solamente a las aves, o entérica que puede o no producir problemas entéricos en las aves y que pueden afectar a los seres humanos, como se muestra en la Figura 1. Infecciones sistémicas que afectan solamente a las aves, como Salmonella Pullorum y Salmonella Gallinarum representan un serio problema en la industria avícola de la región, que determinan las enfermedades clínicas características que producen grandes perjuicios a la industria avícola. Estas dos salmonelas son hospedero-específicas en el caso de las aves, igual que otras que afectan diferentes especies como Salmonella Typhi y Salmonella Paratyphi en humanos, Salmonella Cholerae-suis exclusiva de cerdos y Salmonella Dublin en bovinos.

Por otro lado, se tienen las otras salmonelas, las entéricas como Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Salmonella Heidelberg, Salmonella Kentucky y otras, son especies ubicuas paratíficas que pueden afectar cualquier especie animal inclusive el ser humano. Este grupo es capaz de colonizar el tracto gastrointestinal de diferentes especies. En las aves persisten en el intestino, sin signos clínicos, invaden la corriente sanguínea, y llegan a diferentes órganos internos, favoreciendo la contaminación de carcasas y huevos.

MUESTREO: LO MÁS IMPORTANTE ¿CÓMO HACERLO? 

Algunas consideraciones previas al muestreo:

1. Las aves de las cuales se obtienen las muestras no se deben haber tratado con antimicrobianos (antibióticos) por 3 semanas. 

2. Si las aves están tratadas no intente aislar Salmonella, ya que los resultados serán negativos, estará gastando dinero en diagnóstico inútilmente ya que no aislará nada, sin embargo, puede tener la infección persistente en su granja.

3. En caso tenga presencia de o infestación en la granja por piojos o por Alphitobius diaperinus, puede colectar muestras de estos insectos vivos, porque generalmente contienen el microrganismo y puede cultivarse a partir de ellos.

4. Recuerde que la excreción de Salmonella es intermitente, por lo tanto, muestras de hisopados cloacales, no siempre son la mejor manera de aislarla de un galpón.

Salmonelas que afectan a las aves: Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum

Muestras preferenciales: 

a) Seleccione aves vivas enfermas con signos de enfermedad o aves recién muertas. Pueden servir de muestras aves con sospecha de enfermedad, o aves sanas provenientes de un lote positivo o sospechoso.

b) Tome muestras de tejidos frescos obtenidos post mortem, obtenidos de forma aséptica, a partir especialmente de: bazo, hígado, vesícula biliar, ovarios y oviducto, ciegos, corazón, pulmones, tracto digestivo, testículos.

c) Recuerde que Salmonella Pullorum y Salmonella Gallinarum en bajas cantidades asociada a aves portadoras, son difíciles de aislar en muestras de heces o del medio ambiente.

Salmonelas entéricas que afectan a cualquier especie inclusive el hombre

Para las otras salmonelas, por ejemplo: Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Heidelberg, Salmonella Infantis, Salmonella Kentucky o cualquier otra paratífica, las muestras preferenciales son las siguientes:

a) Para estas salmonelas pueden utilizarse muestras de órganos frescos de animales muertos o sacrificados, muestras de heces o de cama, muestras ambientales (polvo preferencialmente), muestras de ingredientes, etc.

¿Cómo procesar las muestras en el laboratorio?

Las Muestras:

1. Para el caso de muestras de ingredientes para la fabricación de alimentos para aves, de productos avícolas (carne y huevos), muestras medioambientales, deben colectarse como mínimo 25 gramos, multiplicando esto por 9 para determinar la cantidad de agua peptonada (0,5%) para diluir en proporción 1:10. Se tritura y homogeniza la muestra con agua peptonada con la ayuda de un triturador o stomacher. Se coloca para incubar el recipiente estéril a 37±1 oC por 18 a 20 horas.

2. Para SALMONELLAS QUE AFECTAN A LAS AVES (Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum), Los tejidos frescos: bazo, hígado, ovarios y oviducto, ciegos, corazón, pulmones, tracto digestivo, testículos, cáscara de huevo, contenido del huevo, embriones, y otros debe colectarse los órganos enteros. Para hacer detección pueden procesar individualmente las muestras de cada órgano o agruparlas por dos órganos, por ejemplo: bazo e hígado, ovarios y oviductos, ciego e tracto digestivo, corazón y pulmones, etc. Colocar las muestras asépticamente en bolsas plásticas estériles (Whirl Pak o equivalente). Retirar el aire para macerar las muestras. Macere los órganos con cuidado de manera manual dentro de las bolsas, con cuidado de no rasgar las bolsas. Utilice un lápiz, un pedazo de madera liso sin astillas, o cualquier objeto que permita macerar los órganos de manera homogénea. Es necesario tener en cuenta que el aislamiento desde las muestras cloacales y de heces generalmente no tiene éxito.

El enriquecimiento – breve resumen de la metodología:

a) Para Salmonelas que afectan a las aves (Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum) se puede sembrar:

- Directamente a partir de los tejidos o tejidos macerados en Agar McConkey donde las colonias son lisas y sin color. Puede usarse Agar XLD (agar xilosa-lisina-desoxicolato) donde las colonias de Salmonella Pullorum crecen formando colonias pequeñas de color rojo y las de Salmonella Gallinarum generalmente pueden tener una mancha negra central debida a la producción de H2S. 

- También se recomienda usar para enriquecimiento caldo selenito-cisteína para incubar diferentes tipos de muestras. Para detalles de las proporciones y metodología detallada se recomienda consultar el capítulo 2.3.11 del Manual de la OIE (http://web.oie.int/esp/normes/mmanual/pdf_es_2008/2.03.11.%20Pulorosis%20y%20tifosis%20aviar.pdf)

b) Para salmonelas entéricas que afectan a cualquier especie:

- Deben colectarse como mínimo 25 gramos, multiplicando esto por 9 para determinar la cantidad de agua peptonada (0,5%) para diluir en proporción 1:10. 

- Se tritura y homogeniza la muestra con agua peptonada 0,5%. 

- Se coloca para incubar el recipiente estéril a 37±1 oC por 18 a 20 horas.se siembra de la bolsa de la muestra un volumen total de 0.1 ml y se distribuyen 3 gotas de manera separada y a la misma distancia, mediante pipeta automática con punta desechable estéril, en una placa de Rappaport-Vassiliadis medio de cultivo selectivo semisólido previamente aditivado con una solución de novobiocina. Se incuban las placas a 41.5±1oC durante 24±3 horas. 

- El medio semisólido DIASALM se utiliza también para aumentar la sensibilidad del proceso de aislamiento, y utilizar dos temperaturas de incubación (37oC y 40oC, por ejemplo).

- Paralelamente, se transfiere 1 mL de la misma bolsa incubada a un tubo de 10 ml de caldo Müller-Kauffmann Tetrationato Novobiocina (MKTTn), previamente adicionado con una solución de novobiocina y una solución de yodo-yoduro potásico. Puede utilizarse también caldo tetrationato sin novobiocina. Se dejan incubar los tubos a 37±1oC durante 24±3 horas. Este paso, se debe prolongar, y dejar incubar 48, 72 y hasta 96 horas. En caso se quiera realmente verificar la ausencia de Salmonella, transferir 1mL de la bolsa incubada inicialmente después de las primeras 24h, a una bolsa nueva con medio nuevo Tetrationato con o sin novobiocina. Cargas bajas de Salmonella requieren de tiempo y medio selectivo para multiplicación. 

¿Cómo confirmar la cepa aislada?

Una vez que se observan colonias sospechosas es recomendable hacer la confirmación utilizando: pruebas bioquímicas, pruebas serológicas y pruebas moleculares (PCR). 

Para Salmonelas que afectan a las aves:

Utilizar para la bioquímica el medio Agar TSI (agar hierro triple azúcar) siembre por picadura y estría en la superficie, y luego haga la lectura verificando el siguiente cuadro:

Para Salmonelas que afectan a cualquier especie:

Aislamiento en agar no selectivo / bioquímica (mayores detalles consultar el capítulo 2.9.8 del manual Terrestre de la OIE adoptado en mayo de 2016). 

- Se toma al menos una colonia típica o sospechosa y se vuelve a aislar en una superficie de agar nutritivo con la ayuda de un asa de siembra desechable estéril y se realiza una estría por agotamiento con el fin de obtener colonias totalmente aisladas.

- Se incuban las placas de manera invertida a 37±1oC durante 24±3 horas. Confirmación de las colonias sospechosas de Salmonella

- A partir de las colonias crecidas en agar nutritivo se realiza una siembra en un tubo de agar con hierro Kligler. Con la ayuda de asa estéril se realiza una primera siembra en una picadura en el interior del agar y luego una segunda siembra en forma de zig-zag en la superficie inclinada.

- Se incuban los tubos Kligler a 37±1oC durante 24 horas. Se realiza una primera lectura para verificar el crecimiento y si es necesario se dejan incubar 24 horas más. 
La mayoría de Salmonella spp son Glucosa +, Lactosa -, existiendo variantes según la cepa. Los cambios de color se pueden interpretar según la tabla siguiente:

 La serología:

Una vez que la bioquímica ha confirmado que se trata de Salmonella, se puede realizar la confirmación serológica utilizando antisueros comerciales:

  1. Somáticos polivalentes: permite la reconfirmación de género, es decir que las colonias enfrentadas a este antisuero aglutinan cuando se trata de Salmonella por la presencia del antígeno somático O.
  2. Somáticos monovalentes: los hay para indicar a que grupo pertenecen las Salmonellas aisladas. Grupo O4 (antiguo grupo B) Salmonella Typhimurium, Grupo O9 (antiguo grupo D) Salmonella Enteritidis
  3. Flagelares polivalentes: permiten la confirmación que se trata de salmonelas móviles, es decir aquellas que afectan a cualquier especie animal inclusive el hombre, relacionada a la presencia del antígeno flagelar H. Recuerde que Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum no reaccionan con este antígeno porque son inmóviles.
  4. Flagelares monovalentes: permiten la confirmación de especie. Se recomienda en estos casos enviar la cepa para confirmación en un laboratorio de referencia.

NO OLVIDE QUE:

  • Para el diagnóstico de salmonelas que afectan a cualquier especie inclusive al hombre, exija que el laboratorio donde se realizan las pruebas esté certificado ISO 17025 y que tenga la acreditación para la realización de la prueba según la ISO 6579:2003 y sus modificaciones.
  • Si utiliza antibióticos en la granja, dependiendo del tipo y grupo de antimicrobiano, difícilmente aislará Salmonella en la granja, teniendo siempre resultados “falsos negativos”, y estará contribuyendo a la persistencia de la bacteria en sus instalaciones y a la generación de cepas resistentes a los antibióticos.
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