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Thursday, 21 September del 2017


Control de la Coriza Infecciosa: Una actualización

Los genes del profago integrados en el genoma del huésped pueden codificar para diferentes factores de virulencia como toxinas, reguladores y enzimas, lo cual tiene la habilidad de alterar la virulencia bacteriana en el huésped.

Control de la Coriza Infecciosa: Una actualización
Junio 26/2014
Lima - Perú
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Introducción

La coriza infecciosa continúa siendo una seria amenaza para la producción avícola, particularmente en la regiones tropicales y subtropicales. Este grupo de investigación ha estado trabajando en esta enfermedad por muchos años y aunque se han logrado algunos progresos hacia el control de esta infección, todavía hay mucho trabajo por hacer. En esta presentación, se revisarán aspectos del trabajo de indagación que han sido publicados por mi grupo de investigación; así como algunas lecciones sobre el control de coriza infecciosa que hemos aprendido de la situación en Sudáfrica. En la parte final de esta presentación serán discutidas algunas de nuestras actuales averiguaciones sobre este mal.

Información básica

La coriza infecciosa es causada por la bacteria Avibacterium paragallinarum (anteriormente llamada Haemophilus paragallinarum) (Blackall y col., 1990; Blackall y col., 2005). El cultivo de esta bacteria es complicado y requiere para su crecimiento nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) y un ambiente con un nivel reducido de oxigeno (Blackall y col, 1990). Variantes independientes del NAD han sido halladas en Sudáfrica y México (Bragg y col., 1993); (Miflin y col., 1995; García y col., 2001). Uno de los principales problemas que enfrenta el cultivo de la bacteria es que este agente no sobrevive por mucho tiempo fuera del huésped.

La selección de muestras para el aislamiento de las bacterias del campo también es crítica. Muestras provenientes de pollos que presentan signos clínicos avanzados generalmente no son convenientes, porque -con lo delicada que es la bacteria- con frecuencia crecen demasiados patógenos oportunistas. Normalmente, las muestras son cultivadas en agar sangre triptosa y el NAD que es necesario es suministrado haciendo rayas de un inóculo con Staphilococcus aureus que produce el NAD, que se difunde en el agar, y A. paragallinarum crece formando las características colonias satélite (grandes colonias que están muy cercanas a las rayas del S. aureus y disminuyen de tamaño al alejarse del cultivo [Page, 1962]).

Serotipos y protección cruzada

El aspecto más importante relacionado con el control de la coriza infecciosa es el serotipo de la cepa. El primer trabajo en serotipificación se basó en la prueba de aglutinación en placa, donde se encontraron tres diferentes serogrupos (A, B y C) (Page, 1962). Después, la prueba de hemoaglutinación y la inhibición de la hemoaglutinación revelaron 7 diferentes serovares (Kume y col., 1983) y Pat Blackall sugirió un cambio en la nomenclatura después que su grupo encontró dos nuevos serotipos en Australia (Blackall y col., 1990; Eaves y col., 1989). Actualmente, hay 9 serovares reconocidos, 4 en los grupos A y C y uno en el serogrupo B.

Se estableció que no hay protección cruzada entre los diferentes serogrupos (Soriano y col., 2004). Hay una buena protección cruzada entre los diferentes serovares del serogrupo A; sin embargo, hay algunos que no tienen protección cruzada dentro del serogrupo C. El serovar C-3 es particularmente problemático en cuanto a la protección cruzada. Básicamente, no hay protección cruzada entre el serovar C-3 y el serovar C-2 o el C-1 (cepas que son las principalmente usadas en la producción de vacunas).

Hay algo de evidencia de que los serovares pueden estar geográficamente aislados. Los serovares A-4 y C-4 solo han sido hallados en Australia. Del Serovar C-3 se pensó que estaba limitado a Sudáfrica, pero este también ha sido encontrado en Israel e India. Debido a la limitada protección cruzada entre el serovar C-3 y las otras cepas del serogrupo C, la prueba de inhibición de la hemoaglutinación con el serovar C-3 con frecuencia no funciona y muchos aislamientos son clasificados como “no tipificables”. En estos casos, se ha observado que muchas de estas cepas son del Serovar C-3.

Lecciones de historia de la coriza infecciosa en Sudáfrica

Algunas lecciones pueden ser aprendidas de la situación de coriza infecciosa en Sudáfrica. En la década de los 70 esta enfermedad fue un gran problema.

(Bragg y col., 1996). Una vacuna fue producida conteniendo el serogrupo A, la cual trabajó bien por un tiempo, pero los problemas comenzaron a presentarse de nuevo. Esta vacuna fue ajustada incluyendo también el serogrupo B, lo que produjo algunos buenos resultados. A mediados de los 80s fueron introducidas en Sudáfrica vacunas de multinacionales que en su mayoría contenían A-1 y C-1 ó C-2 y también contenían algo de B-1. Estas vacunas también trabajaron bien por algún tiempo; y a mediados de los 90s la coriza volvió a ser un gran problema (Bragg y col., 1996).

Hubo una gran recolección de muestras en los 70s, 80s y 90s que pudieron ser serotipificadas y se encontró que la incidencia de coriza antes del uso de cualquier vacuna (en los 70s) fue muy similar para A-1, C-2 y C-3, con cada serovar responsable de cerca del 32% de los casos (Bragg y col., 1996). Hacia mediados de los 90s, después de la introducción de las vacunas de multinacionales, se encontró que sólo el 4% de los casos de la enfermedad fueron causados por el serovar A-1; esto demuestra que las vacunas fueron altamente efectivas en controlar los serogrupos de la cepa A. La incidencia de casos causados por el serovar C-2 también tuvo una disminución de cerca del 20%; esto también demostró que las vacunas fueron efectivas. De otro lado, la incidencia de casos causados por el serovar C-3 se ha incrementado en cerca del 73% (Bragg y col., 1996). Es conocido que solo hay una limitada protección entre el serovar C-1 ó C-2 y el serovar C-3. Entonces, lo que se puede deducir de la situación de Sudáfrica es que por el uso de vacunas que no contenían el serovar C-3, este fue seleccionado de manera efectiva. Las vacunas en uso confirieron protección contra A-1 y C-2 y estos serovares fueron controlados. El serovar C-3 no fue controlado y fue capaz de propagarse.

Modelo de desafío

Un modelo de desafío “por contacto” fue creado para coriza infecciosa (Bragg, 2002). En este modelo, un ave en un grupo de 10 es desafiada por la bacteria de desafío; de esta forma, el patógeno se dispersa en forma horizontal a las otras aves. La severidad de los signos clínicos en cada ejemplar es evaluada por 20 días y es posible obtener la calificación promedio de la enfermedad para el grupo.

La calificación diaria de la enfermedad puede ser graficada, lo que permite una evaluación fácil de la virulencia o la protección. Este sistema también permite el análisis estadístico.

Virulencia de las cepas

Usando el anterior modelo de desafío, se pudo establecer que las cepas del serogrupo B tienen muy baja virulencia. Se encontró que el serovar A-1 es más virulento que los serovares del serogrupo B, pero la virulencia fue mucho más baja que la de las cepas del serogrupo C. Se supo que el serovar C-3 era el más virulento (Bragg, 2002). ¡Esto crea un problema! porque también hay una limitada protección cruzada entre C-3 y las cepas del serogrupo C más usadas en la producción de vacunas.

Producción de vacunas

Las vacunas experimentales que fueron producidas con cepas del serovar C-3 demostraron conferir una buena protección contra todas las cepas de A paragallinarum en Sudáfrica. Cuando se evaluó el nivel de protección de algunas vacunas comerciales, en un caso se encontró 0% de protección cuando las aves fueron desafiadas con el serovar C-3 (Dungu y col., 2009).

Fallas vacunales percibidas

Después de cambiar algunas vacunas usadas por aquellas que contenían el serovar C-3, se presentaron reportes de fallas en la vacunación; esto posteriormente fue investigado. Cuando se evaluaron los niveles de protección obtenidos con vacunas que contenían el serovar C-3, se encontró que se lograron niveles de protección entre 80-90% (Bragg, 2005). Esto es muy bueno para una vacuna de origen bacteriana, donde no se logra el 100% de protección. También, se estableció que el serovar C-3 es altamente virulento. En aves vacunadas y desafiadas con el serovar C-3, se observaron altos niveles de protección, incluso con la presentación de signos clínicos de coriza infecciosa.

En un experimento realizado, pollos vacunados fueron desafiados con el serovar C-3 y aves no vacunadas fueron desafiadas con aislamientos del serogrupo A. Los signos clínicos en ambos grupos de aves fue similar, incluso hubo 80% más de protección en las aves vacunadas y desafiadas con el serovar C-3 (Bragg, 2005). La extremada alta virulencia del serogrupo C-3 hace que el control efectivo de esta cepa sea muy difícil.

Alternativas a la vacunación – desinfección continúa

En efecto cuando se registraron altos niveles de protección, los signos clínicos de las aves desafiadas con el serogrupo C-3 nos llevaron a investigar alternativas para el control de la enfermedad. Las investigaciones de nuestro grupo se enfocaron en un programa de desinfección continua con el nuevo y altamente efectivo desinfectante no toxico Virukill (Bragg, 2004). Se demostró que el uso de un programa completo de desinfección que incluye tratamiento en el agua de bebida y una desinfección regular del ambiente, resultó en una reducción significativa de la calificación de los signos clínicos en aves vacunadas y no vacunadas.

Serotipificación molecular

Existe necesidad de mejorar el sistema de serotipificación. Las pruebas de hemoaglutinación e inhibición de la hemoaglutinación son subjetivas y no son aceptadas actualmente para la publicación de nuevos serovares. En los estudios de nuestro grupo, actualmente se están investigando los métodos de serotipificación molecular. Algunos han sido publicados, tales como el ERIC-PCR (Soriano y col., 2004b) y los métodos de serotipificación molecular de Sokamoto y colaboradores (2013); estos dos métodos moleculares no fueron reproducibles en nuestro laboratorio. El ERIC-PCR trabajó bien con cada una de las cepas de referencia, dándoles un parámetro diferente de bandas. Sin embargo, cuando se evaluaron aislamientos de campo, se observó que no se correlacionó con las cepas de referencia y cada cepa de campo resultó en un parámetro único de bandas, lo que significa que el ERIC-PCR no es apropiado para la serotipificación.

Sakamoto y colaboradores (2013) no reportaron su método de serotipificación usando cepas de referencia. Cuando usamos este método con todo el juego de cepas de referencia, el sistema de serotipificación no resultó ser cierto. Con relación a Sakamoto y colaboradores, hallamos muchas cepas de referencia que pudieran ser clasificadas como del serogrupo B, esto indica que este método no es confiable.

Las investigaciones de nuestro grupo, actualmente han establecido un método que da consistencia a los perfiles de bandas para la diferenciación de los serovares C-3 y C-2. Basados en los niveles de protección cruzada, esto es una importante diferenciación entre los actuales serovares reconocidos. Usando este sistema, han sido identificados nuevos posibles serovares analizando muestras de varios países y las investigaciones continúan.

Bacteriófagos

Se obtuvo una secuencia completa del genoma de la cepa Modesto (C-2). Una vez revisados los genes relacionados con el fago se encontró que el genoma completo del HP-2 se parece al fago Mu (Roodt y col.,2012). Se postuló que la presencia de profagos puede tener un efecto en la virulencia y patogenicidad de la especie bacteriana (Wagner & Waldor, 2002). Los genes del profago integrados en el genoma del huésped pueden codificar para diferentes factores de virulencia como toxinas, factores reguladores y enzimas, lo cual tiene la habilidad de alterar la virulencia bacteriana en el huésped (Wagner & Waldor, 2002).

Uno de tales ejemplos es el caso de la cepa avirulenta de Corynebacterium diphteriae que fue infectado con un bacteriófago que produjo lisógenos virulentos que produjeron toxinas de difteria, que causó la difteria en humanos (Tinsley y col.,2006). Otro ejemplo de esto es la producción de la toxina escarlatina por un bacteriófago moderado dentro del genoma del Streptococcus no toxico (Wagner & Waldor, 2002; Tinsley y col., 2006). Todas las cepas de referencia, las cepas seleccionadas de las vacunas y varios aislamientos de campo fueron evaluados para los genes similares a HP2 y fagos similares a Mu. Los genes fago fueron hallados en todos los aislamientos evaluados; sin embargo, todos los genes analizados se presentaron en 4 de las cepas evaluadas. Esto sugiere que los elementos genéticos de estos fagos tienen remanentes de evolución y no sabemos si en este estado hay genes fago jugando un papel de virulencia. Futuras investigaciones involucrarán el análisis de la localización de los genes fago dentro del genoma de A. paragalllinarum y los promotores activos asociados con los genes fago.

Microarreglos e inmunidad innata

Se realizó un experimento para entender la respuesta de la inmunidad innata en aves desafiadas con el serovar altamente virulento C-3 usando la tecnología de microarreglos (Boucher y col., 2014). Una gran cantidad de datos se generó de este experimento y estamos en el proceso de analizarlos.

De los datos obtenidos con la tecnología de microarreglos se halló que el receptor Toll (TLR 7) fue altamente regulado en pollos infectados con el serovar C-3 (Bucher y col., 2014). El TLR 7 está reportado como el único sobre regulado en presencia de la cadena viral simple del ARN (Janeway y Medzhitov, 2002). El hecho de que el TLR 7 fuera significativamente sobre regulado en aves desafiadas con el serovar C-3, nos permite postular que el TLR 7 estuvo posiblemente estimulado por estos bacteriófagos, probablemente contribuyendo a la virulencia de la infección bacteriana (Boucher y col., 2014).

Un trabajo futuro incluirá investigaciones de la sobre regulación del TLR 7 con otros serovares del A. paragallinarum usando el PCR en tiempo real cuantitativo.

Conclusiones

La Coriza Infecciosa permanece como un problema importante alrededor del mundo.

La correcta identificación de los serovares causantes de los problemas en un país, es de vital importancia para el desarrollo o selección de las vacunas que puedan conferir la mejor protección. Sin embargo, incluso cuando las cepas correctas son incluidas en la vacuna, los signos clínicos de la enfermedad pueden ser observados, particularmente cuando las aves están desafiadas con aislamientos de campo altamente virulentos. Alternativas tales como mejorar la bioseguridad, son críticamente importantes para el control de la enfermedad.

Otras opciones de control también necesitan ser investigadas ya que parece que las actuales opciones de vacunación usando vacunas inactivadas, pueden no controlar completamente el problema.

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