Actualidad Avipecuaria
miércoles, 14 noviembre del 2018

(1)(2)Dra. Ana Chumbe, (1)(2)Dr. Ray Izquierdo-Lara, (1)Dra. Katherine Calderón, (1)Dr.Manolo Fernández-Díaz y Dr. Vikra Vakharia

(1)FARVET S.A.C.

(2)Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Escuela de Medicina Veterinaria, Lima - Perú.

(3)Instituto de Tecnología Marina y Ambiental, Universidad de Maryland - USA.



Desarrollo de un nuevo test de neutralización de la enfermedad de Newcastle (NDV) Basado en un NDV recombinante que expresa la proteína verde mejorada (Parte I)

Desarrollo de un nuevo test de neutralización de la enfermedad de Newcastle (NDV) Basado en un NDV recombinante que expresa la proteína verde mejorada (Parte I)
Septiembre 05/2018
Lima - Perú
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Resumen de estudio científico

Introducción: la enfermedad de Newcastle es una de las enfermedades infecciosas más importantes de la industria avícola, y es causada por el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV). Este virus está distribuido en todo el mundo y puede causar pérdidas graves en la economía de la industria de aves debido a los brotes recurrentes en pollos vacunados y no vacunados. La protección contra el NDV en pollos ha sido asociada con el desarrollo de la respuesta humoral. Aunque el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI) y el ELISA no corroboran la presencia de anticuerpos neutralizantes (nAbs); ellos son usados para medir la protección y respuesta inmune contra NDV.

Métodos: en este estudio, hemos establecimos un sistema de recuperación para un NDV recombinante (rLS1) a partir de un clon de cDNA, que es capaz de aceptar genes exógenos en las posiciones deseadas. Un gen conteniendo la proteína verde fluorescente mejorada (eGFP) fue diseñado en la primera posición del genoma y generamos un NDV recombinante que portaba la eGFP. El virus reportero NDVGFP se utilizó para desarrollar una prueba de neutralización basada en la eGFP (eGFP-NT), en la que los títulos de nAbs fueron expresados como el título recíproco de la dilución más alta que expresaba la eGFP.

Resultados: la eGFP-NT dio resultados concluyentes en 24 h sin usar ningún procedimiento de tinción adicional. Un total de 57 las muestras de suero fueron analizadas mediante neutralización convencional (NT) y eGFP-NT. Además, el HI y un kit de ELISA comercial se evaluaron con el mismo conjunto de muestras. Aunque el HI (R2 = 0.816) y el ELISA (R2 = 0.791) mostraron correlaciones sustanciales con la NT convencional, la eGFP-NT mostró una correlación más alta (R2 = 0,994), indicando que la eGFP-NT es un método más preciso para cuantificar nAbs.

Conclusiones: en general, la prueba de neutralización desarrollada aquí es un método simple, rápido y confiable para la cuantificación de nAbs específicos para NDV. Es adecuado para evaluación de vacunas y ensayos diagnósticos.

Introducción

El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es el agente causal de una enfermedad altamente contagiosa y mortal que afecta a las aves de corral y otras especies de aves en el mundo [1]. Cepas virulentas de NDV son capaces de causar una alta mortalidad (hasta 100%) en pollos no vacunados [1]. NDV es un miembro del género Avulavirus de la familia Paramyxoviridae en el orden de Mononegavirales [2]. Este virus tiene un genoma no segmentado de ARN de cadena simple de sentido negativo, que contiene una secuencia 3'-leader y una secuencia 5'-trailer, esenciales para la transcripción y replicación de virus, y sigue la regla de seis [3]. NDV posee seis genes estructurales: Nucleoproteína (N), fosfoproteína (P), matriz (M), fusión (F), hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y polimerasa grande (L) [4]. De estas proteínas, las proteínas N, P y L forman el complejo ribonucleoproteico (RNP), que es responsable de la transcripción y la replicación viral [5]. Las proteínas HN y F están ancladas en la envoltura viral como glicoproteínas de superficie: La HN es responsable de la unión del virus al receptor de la célula huésped, y la F media la fusión de la envoltura viral con la membrana de la célula huésped [6]. La proteína F es escindida proteolíticamente a F1 y F2 para la actividad de fusión y la presencia de un motivo polibásico en el sitio de escisión es una principal determinante de la virulencia [6, 7]. Ambas proteínas HN y F son capaces de inducir anticuerpos neutralizantes (nAbs) [8- 12].

La inmunidad humoral juega un papel esencial en la protección contra la infección de NDV. Pollos con altos títulos de anticuerpos usualmente están protegidos. Por ejemplo, pollos jóvenes con altos títulos de anticuerpos maternos están protegidos contra un desafío con una cepa virulenta durante los primeros días [12]. Protección contra el virus ha sido descrita para pollos pasivamente inmunizados con yema de huevo o antisuero de aves hiperinmunizadadas contra todo el virión. Anticuerpos monoclonales contra las proteínas HN y F son capaces de neutralizar el virus, tanto in vitro como in vivo [13-15]. Aunque, los anticuerpos contra F y HN tienen un potencial sinérgico [14]. Recientemente, altos niveles de anticuerpos específicos no solo han sido relacionados con la protección contra la mortalidad, sino también con la reducción de replicación y secreción viral [16]. Por lo tanto, medir los nAbs contra NDV es altamente esencial para evaluar la eficacia de una vacuna.

Usualmente, el ensayo de inhibición de hemaglutinación (HI) y el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) son usados para medir los anticuerpos específicos contra NDV, pero no necesariamente nAbs. El test de neutralización convencional (NT)es laborioso, lleva mucho tiempo y puede ser susceptible a la parcialidad del operador. Por lo tanto, un ensayo de NT rápido, de alto rendimiento y confiable es necesario para la evaluación de nAbs de NDV.

En los últimos años, algunos investigadores han demostrado que virus genéticamente modificados que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) o la GFP mejorada (eGFP) pueden ser utilizadas para la determinación rápida de títulos de nAbs de virus o actividades antivirales [17-21]. La eGFP expresada por estos virus permite la visualización directa de la infección bajo un microscopio de fluorescencia o su automatización, usando una placa de lector de fluorescencia. Estas características hacen del eGFP-NT un método adecuado para superar los inconvenientes de una NT convencional.

En este reporte, describimos la generación de un NDV genéticamente diseñado para expresar la eGFP, a partir de un clon de cDNA, y el desarrollo de un ensayo de NT basado en la eGFP (eGFP-NT) para la rápida detección de nAbs. Nuestros resultados muestran que este método es tan preciso como un método de NT convencional pero una mejor alternativa en términos de ser rentable y eficiente.

Métodos

Líneas celulares

Dos líneas celulares en este estudio fueron utilizadas, DF-1 (derivado de fibroblastos de pollo) y Vero (células de riñón de mono), las cuales fueron adquiridas de ATCC (Manassas,VA, EE. UU.). Ambas líneas celulares fueron mantenidas en medio DMEM F12 (HyClone) suplementado con 5% de suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor, 2.5% de suero de pollo (SChk) (Sigma-Aldrich), 100 U/ mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2.

Construcción de un clon completo de NDV
 

Basados en la secuencia de nucleótidos de la cepa lentogénica de NDV publicada en el GenBank (Número de acceso Y18898) [22], un clon de longitud completa de NDV (pFLCLS1) fue ensamblado en el vector modificado pCI (pCI/-SnaBI) a partir de tres fragmentos superpuestos. La Figura 1 muestra la secuencia de subclonaciones de los tres fragmentos dentro del vector, cada uno en sitios de únicos de restricción, denominados NheI-EagI, BssHIISgrAI y SnaBI-SapI, respectivamente.

Los fragmentos -1 y -2 fueron sintetizados químicamente (GenScript, New Jersey, USA) y contienen secuencias de NDV, y el fragmento -3 se tomó del clon de longitud completa pNDVPE18 previamente recuperado [23], el cual se derivó de la cepa LaSota. El fragmento -1 (4387 nt) que incluye las secuencias (de 5' a 3 ') de la ribozima cabeza de martillo (HHRz), y los genes N, P y parte del M, entre los sitios de restricción NheI y EagI. La secuencia de la HHRz 5'-CTG ATG AGT CCG TGA GGA CGA AAC TAT AGG AAA GGA ATT CCT ATA GTC-3` fue incluida inmediatamente en el upstream de la secuencia leader del virus. El fragmento-2 (5865 nt) consiste del gen parcial M, el gen F, el gen HN y parcialmente el gen de la proteína L y la ribozima del anti-genoma del virus de la hepatitis delta (HDVRz). La secuencia de la HDVRz 5'-GGG TCG GCA TGG CAT CTC CAC CTC CTC GCG GTC CGA CCT GGG CAT CCG AAG GAG GAC AGA CGT CCA CTC GGA TGG CTA AGG GAG AGC CA-3' se insertó inmediatamente al downstream de la secuencia de trailer del virus [24]. El fragmento -3 (4989 nt) contiene la secuencia restante del gen L (4769 nt upstream) entre los sitios de restricción SnaBI y SapI. Todos los cambios de nucleótidos debido a la creación o la eliminación de sitios de restricción en el clon son mostrados en la Tabla 1. Finalmente, la secuencia del genoma de NDV (15,186 nt) se obtuvo en el plásmido resultante pFLCLS1 (19,319 pb). El ADN de este plásmido fue completamente secuenciado por secuenciación de Sanger (Macrogen Inc., Corea) para verificar su integridad.

Construcción de plásmidos de soporte
 

Los plásmidos de soporte fueron generaron a partir del vector pFLC-LS1 usando los cebadores Nfor, Nrev, Pfor, Prev, Lfor y Lrev (Tabla 2). Los marcos de lectura abiertos (Open reading frames: ORFs) fueron amplificados a partir de los genes de la proteínas N, P y L y luego fueron clonados en el vector pCI. Los plásmidos resultantes pCI-N, pCI-P y pCI-L fueron utilizados para la recuperación de los virus recombinantes. Los ORFs de las proteínas N y P se amplificaron mediante PCR usando cebadores específicos para los genes que contienen los sitios de restricción EcoRI y NotI, mientras que el ORF de L fueron amplificados utilizando los cebadores Lfor y Lrev, que a su vez poseen los sitios de restricción SpeI y NotI, respectivamente. El ORF del gen L fue clonado entre NheI y NotI, lo que resultó en la eliminación del sitio de restricción NheI/ SpeI. Todos los cebadores forward contenían la secuencia de Kozak GCCACC inmediatamente arriba del codón de inicio (ATG).

Construcción del plásmido pFLC-LS1-1eGFP
 

Para insertar el gen de la eGFP en el clon completo de NDV, el fragmento A fue sintetizado químicamente (GenScript, New Jersey, USA). El fragmento A esta flanqueado por los sitios de restricción AsiSI y PciI y contiene la secuencia de ribozima HHRz, secuencia leader, el cassette del gen de la eGFP flanqueado por el inicio y el término del gen N e inmediatamente después el gen terminal y un segundo gen de inicio que será parte del cassette del gen N como se muestra en la Fig. 2. Para lograr altos niveles de expresión, el casete de la eGFP se insertó en el sitio más proximal 3' [25] entre los sitios AsiSI y BbvCI del clon por ligación con el fragmento-B (Fig. 2). El fragmento-B contiene los genes N y P flanqueados por los sitios de restricción PciI y BbvCI. Este fragmento fue obtenido por amplificación de PCR con los cebadores NDV116_F y NDV3211_R (ver Tabla 2), usando pFLC-LS1 como template. Ambos fragmentos fueron clonados simultáneamente en pFLC-LS1 entre los sitios AsiSI y BbvCI (Fig. 2). El plásmido resultante fue designado como pFLC-LS1- 1eGFP, el cual contiene el genoma del NDV y el gen de la eGFP y tiene 16.182 nt de longitud, cumpliendo con la regla de seis. El ADN de este plásmido fue completamente secuenciado para verificar su integridad mediante secuenciación de Sanger (Macrogen Inc., Corea).

Transfección y recuperación de virus
 

Alta calidad de ADN plasmìdico fue obtenido a partir de pFLC-LS1, pFLC-LS1-1eGFP y de los tres plásmidos de soporte usando el kit Plasmid Midi (Qiagen). Las células Vero fueron crecidas al 80% de confluencia en una placa de 12 pocillos y luego se cotransfectaron con 1 μg de pCI-N, 0,5 μg de pCI-P, 0,2 μg de pCI-L y 2 μg de pFLC-LS1 o pFLC- LS1-1eGFP, utilizando Lipofectamina ™ LTX y plus reagent (Invitrogen, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, los plásmidos fueron diluidos en 400 μl de medio Opti-MEM (Invitrogen, USA). A continuación, la lipofectamina fue añadida y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células Vero fueron lavadas con la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) y luego se añadió la mezcla de plásmido-Lipofectamina a la monocapa. Después de 4 h de incubación a 37 °C, las células transfectadas se lavaron y luego se mantuvieron en DMEM que contiene 5% de SFB a 37 °C y 5% de CO2.

Al día siguiente, se añadió fluido alantoideo (FA) a una concentración final de 5% y las células fueron incubadas durante 4 días más. El sobrenadante celular se recolectó, se sedimentó a alta velocidad y se inoculó en huevos embrionados de pollos SPF de 8 días de edad y se incubó durante 4 días. Las FAs se recolectaron, se clarificaron y se tomaron alícuotas y fueron almacenados a -80 °C. La recuperación de los virus se confirmó primero mediante el ensayo de hemaglutinación (HA). Para virus parental (rLS1), la presencia de proteína específica de NDV fueron evaluadas mediante inmunofluorescencia y confirmadas por marcadores genéticos mediante RT-PCR y digestiones con enzimas de restricción.

Para confirmar la recuperación del virus rLS1-1eGFP, células DF-1 infectadas fueron observadas bajo un microscopio de fluorescencia.

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