Actualidad Avipecuaria
Friday, 28 July del 2017

K. Huamán1, L. Tataje-Lavanda1, V. Longa1, J. Bendezú1, G. López2, O. Nolasco2, M. Fernández-Díaz1

1 Laboratorio de Biotecnología Molecular y Genómica, FARVET SAC. Chincha Alta, Ica - Perú
2 Instituto de Medicina Tropical “Alexander von Humboldt”, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima - Perú



Desarrollo y validación de una real-tima para la detección y cuantificación del virus de Laringotraqueitis Infecciosa Aviar en fluido alantoideo en concordancia con Good Laboratory Practices (CFR21 Parte 58)

Se desarrolló y validó una qPCR para cuantificar ILTV en fluido alantoideo en vacunas. El método de validación está en concordancia con Good Laboratory Practice (CFR 21 parte 58) y FDA.

Desarrollo y validación de una real-tima para la detección y cuantificación del virus de Laringotraqueitis Infecciosa Aviar en fluido alantoideo en concordancia con Good Laboratory Practices (CFR21 Parte 58)
Febrero 16/2017
Lima - Perú
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Introducción

El desarrollo y validación de técnicas cuantitativas es un factor fundamental para asegurar el análisis y el estado real de las vacunas y así nos permita una buena dosificación en las aves.

Las técnicas moleculares empleadas para la cuantificación de vacunas producidas en fluido alantoideo (FA) como: El ensayo en placa, dosis infectiva al 50% en embrión de pollo (DIE50) entre otros, resultan ser costosas y requieren de mucho tiempo para la emisión de resultado; por otro lado técnicas como la qPCR empleada para este tipo de análisis son más rápidas y de menor costo; sin embargo muy pocas técnicas de qPCR tienen una evaluación sistemática de los parámetros de validación en el proceso de control de calidad de vacunas como indica Good Laboratory Practices (GLP), esto para dar eficiente soporte al control de calidad de las vacunas. Este estudio describe el desarrollo y la validación de una Real-Time PCR (qPCR), para la detección y cuantificación del virus de Laringotraqueitis Infecciosa Aviar (ILTV virus por sus siglas en ingles), utilizando los parámetros de validación como: Precisión, sensibilidad, especificidad, límite de blanco (LoB), límite detección (LoD) y el límite de cuantificación (LoQ).

Objetivo

Desarrollar y validar una qPCR para cuantificar ILTV en fluido alantoideo. El método de validación esta en concordancia con Good Laboratory Practices (GLP), (CFR 21 parte 58) y los lineamientos establecidos por Food and Drug Administration (FDA).

Metodología

La Cepa de ILTV (VFAR-043) se inoculó en huevos embrionados SPF de 9 días vía membrana corioalantoidea, se incubó por 7 días y se cosechó fluido alantoideo (FA), Se empleó una línea celular de fibroblasto de pollo libre a ILTV; luego el ADN total de ambos fue extraído usando QIAamp MinElute Virus Spin Kit (QIAgen). De esta forma se obtuvo Material de Referencia Interno (MRi) y ADN libre a ILTV respectivamente. Se diseñaron un par de cebadores en base a una región altamente conservada dirigido al gen gB de ILTV (ILTF-2 e ILTR-2). Que amplifica un segmento de 132 pb. Se envió a sintetizar y clonar en el plásmido pUC57 con la secuencia del gen de interés a (GenScript). Luego el número de copias del plásmido fue calculado por la ecuación: Copias de plásmido/μl= [Cantidad del plásmido (g/μl) x (6.022 x 1023)] / [tamaño del plásmido (bp) x 660 ].

Se elaboró una curva estándar a partir del plásmido pUC57 con un inserto del gen de la glicoproteína B (gB). La concentración del ADN total fue medida por fluorometría una vez establecida, fue normalizado y llevado a una concentración de 1pg/μl. Todas las muestras en estudio fueron amplificadas en el termociclador (LightCycler®480) y los productos de PCR fueron analizados mediante electroforesis. El número de copias de ILTV fue estimado por qPCR empleando la formula siguiente: [ILTV/μl = (copias gB/5) x (volumen de elución del ADN / volumen de FA) x (factor de dilución)].

El MRi sirvió para establecer parámetros de rendimiento el LoB, LoD y LoQ mediante la derivada de los picos de fluorescencia –d (d/dT). ADN de varios virus cercanos a ILT V fue usado para determinar la especificidad. Test No paramétricos fueron usados para el análisis estadístico con un nivel de confianza al 95%.

Resultado

Para el proceso de validación se obtuvieron los siguientes resultados con respecto a los parámetros descritos en el estudio. La precisión se obtuvo de una data generada de ensayos en días consecutivos para lo cual se implementó gráficos de control estimando el número de copias del gen de la glicoproteína B (gB) con una precisión del 95% (p<0.05). La sensibilidad fue demostrada por valores limites en base a la denaturacion de la temperatura melting donde se determina valores >1.56 (presencia ILTV) y valores ≤ 1.56 (ausencia ILTV). La especificidad fue establecida empleando ADN de cepas cercanas a ILTV y se demostró la capacidad del ensayo a partir de la presencia de un pico único de amplificación de la muestra esperada. El MRI estandarizado a 1pg/μl sirvió para determinar los parámetros de rendimiento mediante la derivada de los picos de fluorescencia –d (d/ dT). En base al cual se calculó el LoB que resultó 0.044; por otro lado se establecieron el LoD que fue 5fg/ul y el LoQ=16.6fg/ul.

Conclusiones

Describimos el desarrollo y validación de una qPCR para la detección y cuantificación de ILTV en fluido alantoideo, en concordancia con Good Laboratory Practices (GLP), (CFR 21 parte 58) y Food and Drug Administration (FDA). La precisión se calculó a un nivel de significancia de 0.05. La especificidad fue demostrada por análisis de distribución y la no presencia de interferentes en el desarrollo de la técnica establecida, determinando que las repeticiones son homogéneas. El LoD se estableció en >1.56 = 5fg/ul que representa la presencia ILTV. Mientras que el LOQ fue determinado en 16.6fg/ ul. Que representa la cantidad mínima capaz de ser cuantificada. La precisión, exactitud y reproducibilidad del ensayo demostraron ser convenientes para cuantificación de ILTV en fluido alantoideo y su aplicación en la determinación de la dosificación de vacunas para ILTV.

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