Actualidad Avipecuaria
Saturday, 24 June del 2017


El desafío de la determinación de la actividad de xilanasas en muestras de alimento

Como toda tecnología, la utilización de ELISA para la determinación de la actividad de xilanasa tiene algunos puntos de control que se deben tener en consideración.

El desafío de la determinación de la actividad de xilanasas en muestras de alimento
Octubre 14/2016
Lima - Perú
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La utilización de enzimas en la nutrición de aves y cerdos ha pasado por un proceso de crecimiento exponencial en los últimos años, de tal forma que hoy es una tecnología de rutina en la producción de alimentos balanceados.

De esta manera, las enzimas exógenas son responsables de una parte importante de los nutrientes presentes en las dietas, o mejor dicho, del incremento del aprovechamiento de los mismos. Además, la adición de enzimas a las dietas no significa que van a permanecer sin alteraciones, porque el procesamiento de las dietas (por ejemplo, la peletización, la expansión, etc.) y la presencia de otros aditivos pueden influir sobre la actividad enzimática. Dicho lo anterior, la determinación de la actividad enzimática en el alimento que se da a los animales se ha convertido en un factor importante en el proceso de garantía de la calidad del mismo, por lo que actualmente es de rutina en el caso del monitoreo de la actividad de fitasa, pero menos frecuente para otras enzimas como las xilanasas.

El presente informe técnico expone los factores y características que dificultan la determinación de la actividad de las xilanasas en alimentos balanceados, además presenta alternativas para incorporar a la rutina de producción esa importante herramienta de garantía de calidad en el proceso de producción de alimentos para aves y cerdos.

1. Metodologías estándar para la determinación de la actividad de las xilanasas y sus limitaciones

Cuando analizamos enzimas en muestras de alimentos, un factor importante a recordar es que no determinamos la cantidad adicionada de la enzima, sino su actividad, es decir el efecto que esa enzima ejerce sobre un sustrato. Lo que inicialmente puede parecer una cuestión semántica, tiene un gran impacto sobre las metodologías, ya que la actividad de una enzima puede variar de acuerdo con varios factores tales como el pH de la solución, la temperatura y la cantidad de sustrato y/o producto de reacción presente. Por eso, siempre se Artículo Técnico Autor: Tiago Tedeschi dos Santos - gerente técnico – Latam Ana Paula Henrique - gerente técnico – Brasil hacen las determinaciones de la actividad enzimática bajo condiciones específicas de pH, temperatura y concentración de sustrato, procurando trabajar cerca de las características óptimas de la actividad de la enzima analizada. Por el mismo motivo, la determinación de la actividad enzimática presenta un alto grado de variación en el análisis, intra e interlaboratorios, pues es difícil estandarizar esas condiciones de manera precisa, lo que puede afectar la actividad a evaluar. Además de eso, debemos recordar que el producto de la reacción enzimática varía gradualmente las condiciones de reacción de la solución, lo que altera sus características. La determinación de la actividad enzimática normalmente se puede hacer de tres formas distintas:

- Desaparición o reducción del sustrato adicionado.

- Aparición del producto de la reacción mediada por la enzima.

- Cambio en las características de la solución ocasionados por la desaparición del sustrato y/o aparición del producto de la reacción.

Comúnmente no se utiliza la determinación de la actividad enzimática mediante la reducción de la cantidad de sustrato. Eso se debe a que generalmente las soluciones diseñadas para la determinación enzimática poseen una cantidad de sustrato extrapolada, lo cual certifica que la cantidad de sustrato no limitará la reacción enzimática. De esta forma, el volumen de sustrato hidrolizado por la enzima a medirse es muy pequeño en proporción a la cantidad total de sustrato en la solución, lo que dificulta el análisis de una manera precisa.

Se puede usar también la determinación mediante cambios de características de la solución, como por ejemplo, en el análisis de la actividad de carbohidrasas mediante la determinación de la viscosidad o incluso en el análisis de la actividad de las fitasas a través de la reducción de la turbidez de la solución, debido a la relación entre fitato y proteína. Sin embargo, esas mediciones presentan algunas limitaciones de interpretación, ya que el cambio de las características de la solución no necesariamente tiene una relación linear con la actividad enzimática y dichos cambios pueden estar relacionados con la actividad de más de una enzima presente en el alimento. Entonces, los análisis que hacen uso de la determinación de cambios de las características de la solución pueden darnos una idea de la actividad enzimática, pero no lo harán de la manera más correcta y precisa.

La metodología más comúnmente empleada en el análisis de la actividad enzimática en muestras de alimento consiste en la determinación del producto de la reacción en solución. El análisis de la fitasa mediante la medición del fósforo libre en una solución de fitato o el análisis de la proteasa a través de la medición de péptidos y aminoácidos en una solución proteica, son ejemplos de la utilización de este tipo de metodología. En los temas que vienen a continuación, veremos que el análisis de la actividad de la xilanasa puede verse influido, como por ejemplo, por la xilanasa comercial adicionada a los alimentos balanceados, interferencias causadas por los ingredientes utilizados en los alimentos, entre otros.

2. Limitaciones en la determinación de la actividad enzimática relacionadas a la xilanasa adicionada al alimento

Puede haber limitaciones en la determinación de la actividad de la xilanasa en muestras de alimento debido a las características del análisis, los ingredientes utilizados en los alimentos y de la xilanasa comercial a analizarse.

a. Limitaciones del análisis

Según lo mencionado con anterioridad, normalmente el análisis de la actividad enzimática se hace por la determinación del surgimiento del producto de la reacción modulada por la enzima que se incubó con el sustrato en condiciones específicas. En el caso del análisis de la actividad de la xilanasa en los alimentos y de otras carbohidrasas tales como la glucanasa, mananasa, etc., nos encontramos con una dificultad, pues el producto de la reacción enzimática, es decir los azúcares libres se encuentran abundantemente en los alimentos balanceados, constituidos generalmente por cereales que son fuente de almidón y azúcares, por lo que es casi imposible la detección de una alteración sutil en la concentración de esos azúcares. La alternativa normalmente usada en situaciones como estas es la utilización de pastillas de sustratos purificados (xilanos en el caso de xilanasa, glucanos en el caso de glucanasa,...) asociados a una sustancia colorida.

En este tipo de situación, la actividad de la xilanasa, por ejemplo, hidroliza la fibra de xilano, con lo que se libera la sustancia colorida que deja la solución azulada, lo cual correlaciona la actividad de la enzima a la intensidad de la coloración obtenida. De cualquier forma, es sumamente importante resaltar que el análisis de la actividad de la xilanasa en muestras de alimento se hace por una metodología diferente de la que se usa para la determinación de la actividad del producto comercial puro.

b. Limitaciones debido a las características de los ingredientes

Los ingredientes de origen vegetal que comúnmente utilizamos en las formulaciones de alimentos para animales, producen cantidades variables de xilanasa endógena. Dicha xilanasa es responsable de la remodelación o crecimiento celular, y en el caso de los granos, es responsable de la degradación de la pared celular durante el proceso de germinación. Además de eso, algunos granos cuentan en su composición con algunas proteínas responsables de inhibir la acción de las xilanasas (lo que se va a analizar en el siguiente tema).

Hay microorganismo como hongos y bacterias que también pueden producir xilanasa con el objetivo de obtener nutrientes para su crecimiento. De esta manera, cuando analizamos la actividad enzimática de la xilanasa en una muestra de alimento, el resultado obtenido no necesariamente corresponde solo a la actividad de la enzima adicionada, sino a un conjunto general de la actividad de la xilanasa y su antagonista presente en dicha muestra (xilanasa exógena adicionada + endógena de los vegetales + microorganismos – inhibidores de xilanasa).

Tanto las actividades de la xilanasa endógena como de la microbiana interfieren en el análisis de los resultados de la actividad de la xilanasa obtenidos de las muestras de alimento, principalmente al considerar que tanto la actividad microbiana como la endógena se obtienen por la presencia de moléculas de xilanasa con baja gastro y termorresistencia. De esta forma, al calcular la resistencia térmica de una enzima xilanasa, por ejemplo, la misma se puede penalizar por la baja termoestabilidad de las enzimas endógenas y microbianas, ya que estarán presentes en mayor concentración en el alimento en harina, pero en menor concentración en la peletizada. Por otro lado, debido a la baja actividad in vivo de dichas enzimas endógenas y microbianas, los resultados del análisis cercano a lo esperado pueden esconder en realidad actividades enzimáticas bajas del producto adicionado.

Es importante resaltar que el impacto de los inhibidores de xilanasa en la determinación de la actividad de esta enzima de los productos adicionados al alimento va a depender del producto escogido. Las diferentes xilanasas tendrán diferentes interferencias, de acuerdo con la presencia de inhibidores. No todas las xilanasas son iguales, como podemos observar por la variación de actividad de las diferentes enzimas en diferentes pH (figura 1).

 

 

Una alternativa para determinar la actividad de xilanasa efectiva del producto adicionado es el análisis de una muestra de alimento sin y otra con la adición de la enzima comercial. De esa forma, se descuenta el valor de la actividad presente en el alimento sin enzima del valor obtenido en el alimento con adición de enzima, para así calcular la actividad real de la enzima adicionada. A pesar de ser una alternativa posible, este procedimiento presenta algunas limitaciones con la dificultad de recolección de muestras sin adición de enzima en la rutina de algunas plantas de alimento, el aumento del volumen de muestras necesarias para acercarse a los resultados y la inclusión de una variable de error de más en el proceso.

Esto es porque el procedimiento anterior tiene en consideración que la actividad endógena y microbiana está distribuida uniformemente en la mezcla del alimento, cuando en realidad esta actividad es variable, en función de la concentración de hongos en diferentes partes de la mezcla y de la distribución del alimento, pues la actividad de la xilanasa endógena presenta mayor o menor concentración, dependiendo de la porción del grano. Esta acumulación de errores, aunque pequeños individualmente, puede generar variaciones importantes en el análisis final de los datos generados.

c. Limitaciones debido a las características de la enzima a analizar

Una de las formas de protección de los cereales contra el ataque de hongos y bacterias es la producción de proteínas inhibidoras de xilanasa. Dichas proteínas actúan como antagonistas competitivos al bloquear el sitio de acción de las xilanasas y al reducir la actividad de estas enzimas, así protege la integridad celular contra posibles ataques de hongos y bacterias. La cantidad de estos inhibidores de xilanasa dependerá del grado de maduración del cereal, tipo de cereal y variedades del mismo cereal, entre otros factores. Tales inhibidores actúan no solo en las xilanasas microbianas, sino también sobre las presentes en los productos comerciales del mercado. Cabe mencionar que hay una gran variación en el grado de inhibición que pueden presentar las xilanasas comerciales.

 

 

Como ese es un mecanismo de defensa de los cereales con la finalidad de inactivar el efecto de la enzima, entonces podemos suponer que eso podría afectar el efecto in vivo de la adición de xilanasas en los alimentos. Sin embargo, en la literatura existen trabajos que demuestran que se trata solamente de un problema análitico (que dificulta el análisis in vitro) y que no afecta la eficiencia de la enzima y otros que demuestran que realmente puede haber un efecto negativo en enzimas.

La verdad es que dichos productos sensibles a los inhibidores de xilanasa sufrirán el impacto de la presencia de los mismos y presentarán actividades por debajo de las esperadas.

Para superar este problema, muchos proveedores de xilanasas comerciales utilizan un procedimiento denominado “spiking”. En dicho procedimiento se utiliza una muestra de alimento con y otra muestra sin adición de enzima. Durante el proceso de extracción se incluye junto con la solución extractora una cantidad extra (y conocida) de enzima en la solución. El objetivo es que los inhibidores de xilanasa vayan a actuar/inhibir la cantidad extra de enzima adicionada, para dejar la xilanasa previamente adicionada al alimento “libre” para mantener su actividad y analizarse de forma adecuada.

El cálculo de la actividad de la muestra con enzima se hace por la diferencia de actividad en los alimentos con y sin adición de xilanasa. Las limitaciones de ese procedimiento serían la necesidad de obtener una muestra del mismo alimento a analizarse sin adición de xilanasa comercial y una muestra del mismo producto que será analizado.

Además, es un procedimiento que genera un cálculo extra, que trae consigo una acumulación de errores en el proceso del análisis final, y da incluso más inconsistencia y variabilidad para el análisis.

3. Determinación de la actividad de xilanasa en muestras de alimento mediante la metodología ELISA

La tecnología de ELISA se ha usado de forma rutinaria en otras áreas como la determinación de la concentración de micotoxinas en muestras de alimento o la presencia de anticuerpos en muestras de sangre, la cual puede ser una alternativa también para la determinación de la actividad de xilanasa en muestras de alimento. En dicha alternativa, se utilizan anticuerpos contra la molécula a analizarse (ya sean las micotoxinas y anticuerpos en los casos descritos con anterioridad, así como para la molécula proteica de la enzima xilanasa adicionada al alimento para el caso de la utilización en la determinación de la actividad de xilanasa), los cuales se ligan a una molécula de prueba y en un proceso específico se leen mediante la inclusión de un agente reactivo de color. Cuanto mayor sea la reacción de color, mayor es la concentración del producto de prueba. Esa reacción de color puede entonces compararse con las concentraciones estándar de la misma molécula de prueba, con lo que se calcula con precisión la concentración de esa molécula en la muestra analizada.

 

 

Como toda tecnología, la utilización de ELISA para la determinación de la actividad de xilanasa tiene algunos puntos de control que se deben tener en consideración. En este caso específico, el principal punto de control es el desarrollo de anticuerpos monoclonales que reaccionen solo contra la enzima xilanasa activa que se adiciona al alimento. Los anticuerpos monoclonales no van a reaccionar con posibles productos de la competencia y/o hasta incluso las xilanasas endógenas y/o microbianas producidas por los cereales componentes de los alimentos o por posibles contaminaciones fúngicas, con lo que se garantiza la seguridad del método. Es importante incluso analizar si el anticuerpo desarrollado presenta reacciones de unión positiva contra la enzima objetivo desnaturalizada. Por el hecho que los procesos normales de producción de alimento (como el desafío de la peletización) pueden desnaturalizar la xilanasa, es importante que el anticuerpo no reaccione con esa enzima desnaturalizada, con lo cual se evitan resultados falsos positivos, donde el análisis presenta una reacción positiva, pero la enzima no tiene el efecto deseado in vivo.

Ambos controles en el desarrollo de la determinación por ELISA son posibles, ya sea por la evaluación de muestras de alimento sin adición de xilanasa o evaluación de alimentos con otras xilanasas disponibles comercialmente (cuando se espera que el análisis de ELISA dé resultados negativos), o ya sea por la determinación de la actividad de xilanasa en una muestra de alimento con la xilanasa objetivo que sea posteriormente desnaturalizada y vuelta a analizar, donde los resultados antes positivos deban tornarse menores o incluso hasta negativos.

De tomarse las precauciones anteriores, la determinación de la actividad de xilanasa vía ELISA presenta ventajas, incluso en comparación con análisis estándar de determinación de actividad de xilanasa por vía húmeda. En primer lugar, como el análisis de ELISA determina la cantidad de enzima presente en la muestra que se correlaciona con la actividad de muestras estandarizadas, se convierte en un análisis con menos interferencia de las variaciones normales de los procedimientos de análisis, y de esta forma proporciona resultados mucho más consistentes y con mayor repetibilidad.

Además, por ser un análisis más común en el proceso de análisis de laboratorio, es mucho más sencillo y con menos reactivos y equipos que un análisis por vía húmeda estándar. Por último, al no reaccionar positivamente con la presencia de xilanasas endógenas, microbianas y/o de otras enzimas adicionadas, los resultados de actividad de xilanasa obtenidos son mucho más consistentes en ser la actividad real de la xilanasa objetivo, lo que mejora el proceso de control de calidad, pues es esta actividad la que tiene efecto sobre el desempeño animal y la que efectivamente se debe monitorear.

 

 

A nivel productivo, una alternativa más sencilla y fácil para el monitoreo de la presencia de actividad de xilanasa en muestras de alimento, sería la utilización de metodologías cualitativas de la presencia de la enzima objetivo en muestras de alimento.

Esa alternativa se utiliza también de la metodología ELISA para la determinación de la presencia de la enzima en el alimento, pero como el objetivo no es cuantificar la presencia de la enzima, acaba siendo un método mucho más sencillo y práctico para utilizarse en la rutina de análisis de plantas de alimentos balanceados o integraciones.

En esta opción, se mezclan muestras de alimento recolectadas donde se estime que haya la presencia de la enzima con agua para la extracción y solubilización de la enzima, y a continuación dicha solución extraída se pone en contacto con tiras que contengan el anticuerpo para la enzima en cuestión. Al estar presente la enzima en la solución, se da la reacción con el anticuerpo y aparece una línea oscura, lo que comprueba la presencia de la enzima en la muestra de alimento. El beneficio de una prueba como esta es que es muy sencilla y práctica, y se puede utilizar incluso en galpones o casetas de producción con respuestas en menos de 5 minutos.

Para mayor información, contactarse con el Ing. Fernando Cazorla (Director Técnico de Nutrición de Globalvet) al teléfono: 998177945 o al correo: fcazorla@globalvetgroup.com

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