La Enfermedad de Marek, un problema continuo

LA SITUACIÓN GLOBAL ACTUAL

En el presente trabajo se tratarán los diagnósticos correctos o no de Marek y la realidad de los diagnósticos diferenciales de tumores linfoides que representan un problema. Los linfomas neurales en aves jóvenes de menos de 14 semanas de edad o en adultos es una posibilidad, así como los linfomas viscerales en aves jóvenes de menos de 15 semanas de edad, linfomas viscerales de tumores mieloides en aves adultas con bolsas normales o sin bolsas y los linfomas de bolsa en aves adultas.

Cuando se tiene lesiones neurales en aves jóvenes menores a las 15 semanas de edad o en adultos, existe mayor probabilidad de presentar la Enfermedad de Marek, especialmente cuando se combina con tumores viscerales y la fisiología indica que son lesiones de tipo A.

En el diagnóstico diferencial tenemos la Neuropatía Periférica (NP) donde normalmente no se presentan tumores en las aves menores de 4 semanas de edad. Las lesiones son de tipo B con edema y numerosas células plasmáticas. La otra posibilidad en el diagnóstico diferencial es el virus VRE (Virus de Retículoendoteliosis), frecuentemente combinado con una enfermedad de las plumas llamada Nakanuke y las lesiones son de tipo A. Cuando se cree tener la incidencia del VRE, debe confirmarse por la presencia de antígeno de VRE y/o aislamiento viral.

Si el diagnóstico diferencial es crítico se debe realizar histoquímica en los nervios.

Lesiones de tipo A: cuando son Meq positivos (Meq es la proteína de tumores de Marek) y negativas para el VRE existe la presencia de la Enfermedad de Marek. Cuando el Meq es negativo y el VRE está presente, lógicamente hay presencia de VRE.

En las lesiones de tipo B con edema, el virus de Marek tiene la proteína pp38; cuando esta proteína es negativa, Meq es negativo y el VRE es negativo, probablemente tendremos el Síndrome NP (Neuropatía Periférica).

La siguiente imagen muestra una transparencia de NP lesiones. (Figura 2)

En la Inmunohistoquimia de nervios se puede utilizar los anticuerpos con las células T de tipo CD8, que son positivas al VRE, (medio de la imagen) y también son positivos por el antígeno del VRE, es lógico que tenemos VRE. Cuando son negativas para ambas, puede ser el Marek o el Síndrome de NP. (Figura 3)

También vamos a tratar los linfomas en las vísceras, piel, ojo o caña en la ausencia de tumores de bolsa a cualquier edad. Cuando tenemos tumores de bolsa existe la probabilidad de presentar Leucosis linfoide.

Cuando tenemos los linfomas combinados con lesiones neurales se da la Enfermedad de Marek. En el diagnóstico diferencial se incluye la Leucosis mieloide (del virus de leucosis linfoide tipo Y), donde las aves presentan tumores en el cráneo o asociados con las costillas. La leucosis mieloide se da mayormente en razas pesadas, algunas razas ligeras también la han reportado.

Otra posibilidad es el Carcinoma Dermal a células escamosas, que sólo se da en la piel sin tumores viscerales.

El VRE es poco probable en aves jóvenes y siempre será necesario demostrar los antígenos de este virus.

La conclusión es que al presentarse tumores viscerales es más probable la Enfermedad de Marek. Cuando sea necesario hacer un diagnóstico oficial, se debe utilizar histología o inmunohistoquímica. Para eliminar el VRE y el VLA-J es necesario aislar el virus de dos tipos o utilizar el PCR.

La siguiente imagen muestra la histioquímica de linfomas con antígenos para células B (anticuerpos CB1) que en la glucosa de Marek son negativas, lo que también sucede en la glucosa de RE sin tumores en la bolsa (superior izquierda y derecha), en la leucosis linfoide es positiva (inferior izquierda). La imagen muestra que en la parte superior estas células que son positivas con RE cuando hay tumores en la bolsa (inferior derecha). (Figura 4)

La diferencia de Marek con Linfoma No Bursal, es que no presenta células de serie 8, algunas pero no muchas, a diferencia del LNB que presenta muchas células de CD8, además del antígeno de VRE. Para diferenciarla con la Enfermedad de Marek necesitamos observar el genoma viral de ese virus. Tenemos los dos antígenos descritos anteriormente, el Meq que está siempre presente como proteína en tumores y la proteína pp38 que está siempre presente en células dónde el virus se replica. (Cuadro 1)

En la histoquímica se presenta a la izquierda el Meq que es positivo con las células oscuras y también con la proteína pp38, a la derecha tenemos la histoquímica con dos antígenos que están presentes en células tumorales: los av37 y el MATSA, aunque estos dos antígenos también pueden estar presentes en tumores tipo RE y algunas otras células normales. (Figura 5)

En el diagnóstico diferencial empleando un esquema de inmunohistoquimia: Tenemos un tumor cuando existen células t positivas de tipo CD4 y son Meq positivas, siendo el antígeno negativo para VRE, entonces tenemos la enfermedad de Marek.

Cuando tenemos las células CD8 positivas y Meq negativas probablemente encontramos el antígeno positivo para VRE, entonces tenemos RE. Por otro lado, con las células B positivas, el antígeno negativo por VRE y positivo por virus de Leucosis linfoide, tenemos Leucosis Linfoide.

De otro lado cuando el antígeno es positivo por VRE y negativo por virus de leucosis tenemos RE. Esto es muy simple, pero en algunos casos tenemos tumores mezclados de ambos tipos, entonces estos casos son muy difíciles de diagnosticar. (Cuadro 2)

ENFOQUES MOLECULARES PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDAD DE MAREK

La prueba PCR cuantitativa a tiempo real, que puede ser usada para medir la cantidad de copias virales en los diferentes tejidos como el vaso y la pulpa de la pluma.

Recientemente los doctores Gimeno et al. (2011) y Cortes et al. (2011) (Carolina del Norte, Estados Unidos) sugirieron que pueden establecerse niveles umbrales basándose en el número de copias virales en pulpa de las plumas para determinar si pollitos son negativos, infectados en forma latente o portadores de tumores. Sin embargo, sus estudios son más bien preliminares y necesitan datos adicionales considerables para validarse.

Otro problema que muchas veces es una interrogante en campo es: Si mis pollos tienen 50 semanas de edad y presentan tumores ¿Puede ser la Enfermedad de Marek? Publicaciones recientes (Witter y Gimeno, 2006; Ikesawa et al. 2010) y de un grupo de doctores japoneses indican que sí se puede encontrar en pollos SPF (libres de gérmenes patógenos) que nunca fueron contaminados con el virus de Marek, tumores cuando se infectan estos pollos entre las 30 hasta 100 semanas de edad.

La pregunta en el campo es: ¿Estos brotes tardíos son causados por reactivación del virus latente o por una infección novo que ocurrió más tarde en la vida? El problema hasta la fecha es que es muy difícil diferenciar entre infecciones subsecuentes con diferentes virus de serotipo 1.

El doctor Dunn et al. (2010) hizo una prueba muy interesante al respecto. Insertó el gen de pp38 CVI 986 en la cepa muy virulenta llamada Md5 (rMd5//38CVI), lo que permitió la discriminación entre las cepas de serotipo 1: JM o Md5 (M1) y rMd5//38CVI (M2).

Las aves fueron desafiadas con un virus el día 1 y con un segundo virus el día 2 (intervalos cortos) o el día 14 a 19 (intervalos cortos) y fueron monitoreadas por 70 días. Muestras de plumas y tumores fueron analizados por IHQ o pirosecuenciación o asilamiento viral a diferentes fechas, los resultados fueron los siguientes:

En el día 1 se desafió a los pollos con la cepa JM y el día 2 con la cepa Md5 que es mucho más virulenta y tiene gen tipo pp38. Se observó que el segundo virus está presente en casi el 100% de las plumas en los tumores que se encontraron, entonces cuando la cepa está más virulenta que la primera y se desafió con la segunda cepa, al segundo día, se encontró una probabilidad muy alta de tener los dos tipos de virus en los tumores.

Por otro lado, cuando se desafió primero con la cepa M2 y después con la cepa JM, esta última se encontró en 22 o hasta en el 26% de las muestras. Cuando se cambió el desafío hasta 14 días de edad, la cepa JM tiene una protección contra el desafío con la cepa más virulenta. Además no se encontraron cepas M2 en los tumores o en las plumas y lo mismo cuando se desafían con la cepa M2 (más virulenta que la cepa JM), cuando el desafió con la cepa JM fue a los 15 días.

Cuando se toman las dos cepas de Md5, una con la cepa de pp38 se encontró también el mismo resultado o mezcla de los dos virus en la pluma y en los tumores, mientras que cuando se desafiaron con la segunda cepa a los 15 días, la mezcla fue más baja.

Las conclusiones del doctor Dunn fueron: que la superinfección con una segunda cepa es posible. Un intervalo corto entre infecciones por dos cepas incrementa la posibilidad de que la superinfección pueda ocurrir. La infección con una cepa menos virulenta, por ejemplo la cepa JM, seguida por una cepa más virulenta incrementa la probabilidad de superinfección.

Sin embargo, mi conclusión fue que esto no es sorprendente, porque se trata básicamente de la misma situación cuando las aves son vacunadas con cepa CVI988 y después desafiado en el campo. Cuando el desafío ocurre muy pronto se presentan problemas y fallas de vacunas; y cuando hay más tiempo de vacunación y desafío, tenemos una protección mejor.

FALLAS DE LAS VACUNAS

Las fallas de vacunación son frecuentemente causadas por:

- Inadecuadas prácticas de vacunación: demasiada dilución de la vacuna.
- Pobres prácticas de manejo: corto tiempo de inactividad entre lotes, reciclado de cama, la densidad de la población es muy alta, etc.
- Infección con virus inmunosupresores como el virus de Anemia Infecciosa de los pollos, interfiriendo con respuestas inmunes celulomediadas.

Entonces, si se presenta un problema en primer lugar se deben corregir las deficiencias de vacunación y manejo.

El siguiente gráfico es un ejemplo del trabajo de la doctora Gimeno, en el cual se desafiaron por contacto con un virus de muy alta patogecinidad las cepas 648A con dos tipos de vacunas: diluidas con HVT o con dosis completas y las Unidades Formadoras de Placas (UFP) baja, o con el virus bivalente, también diluido o con dosis completa. (Cuadro 3)

Se observa que las líneas oscuras dan la mortalidad y se ve que cuando se da un virus diluido se presentan más problemas de Marek que con la vacuna completa.

Las fallas pueden ser causadas por cepas de VEM con incremento de virulencia comparada con cepas vv+. Hasta el momento existe evidencia limitada por incremento en virulencia o cambios genómicos. En Estados Unidos se han encontrado cepas con una supresión de glicoproteína L (gl). En China se han encontrado cepas diferentes de la CVI988, para gl, gE y meq, mientras que en Polonia las cepas con inserciones LTR –VRE en meq.

Linfocitos T citotóxicos han sido demostrados para gE, gL y gl, siendo este último vinculado con inmunidad protectora. Así estos cambios pueden alterar el reconocimiento inmune y causar inconvenientes en la vacunación.

PRÁCTICAS DE VACUNACIÓN ACTUAL

En los protocolos actuales de vacunación que se utilizan en el mundo, la duda sigue siendo si se debe revacunar o no. Muchos países utilizan la revacunación, pero faltan bases científicas para ese tipo de práctica. Este tipo de vacunación ha incrementado en los últimos años en reproductoras y ponedoras, es así que se usan protocolos diferentes de revacunación en cualquier momento, entre el día de nacimiento hasta 14 días de edad.

El doctor Wu de China, concluye un estudio de campo con revacunación. El siguiente cuadro muestra los datos de este estudio: (Cuadro 4) El color rojo indica la vacunación sola, el color amarillo representa a los pollos de control, después tenemos la vacunación doble, observándose que reduce la incidencia de Marek. Los mismos resultados fueron obtenidos cuando se vacunó con HVT solo o con HVT doble, segundas vacunaciones que fueron realizadas a los 15 días de edad. Entonces, en el campo sí se puede obtener mejores resultados. (Cuadro 4)

Otra práctica que se puede utilizar es el ensayo de PCR a tiempo real para determinar las copias de virus de vacuna en las plumas. Con este tipo de ensayos se pueden obtener resultados para determinar que la enfermedad de Marek fue causada por un virus de vacunación o por la vacunación incorrecta.

Hasta el momento la cepa CVI988 es la mejor vacuna disponible. Se han publicado recientemente los resultados de una vacuna recombinante Md5Meq que causa atrofia severa de timo y bolsa, entonces esta vacuna no está permitida a la fecha en el mercado de los Estados Unidos.

CONCLUSIONES

No hay incremento de la Enfermedad de Marek en los países de América. El diagnóstico de la Enfermedad de Marek no es siempre simple y puede requerir inmunohistoquímica.

Las fallas vacunales son frecuentemente causadas por cepas corrientes debido a errores de manejo o de infecciones de Virus de Anemia Infecciosa de Pollo (VAIP).

La revacunación se usa frecuentemente, pero la razón no está clara.