Friday, 23 June del 2017

Dr. Mauricio J. C. Coppo

Asia-Pacific Centre of Animal Health

Facultad de Ciencias Veterinarias y Agrícolas

Universidad de Melbourne (Victoria-Australia)



Últimos avances y nuevos desafíos en laringotraqueítis infecciosa aviar

El virus de la laringotraqueitis infecciosa (VLTI) es un virus herpes (alphaherpesvirinae) con DNA de doble hebra y una cápside de simetría icosahédrica. Existe sólo un serotipo y produce…

Últimos avances y nuevos desafíos en laringotraqueítis infecciosa aviar
Abril 07/2017
Lima - Perú
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El virus y la infección

El virus de la laringotraqueitis infecciosa (VLTI) es un virus herpes (alphaherpesvirinae) con DNA de doble hebra y una cápside de simetría icosahédrica. Existe sólo un serotipo y produce infección lítica en epitelios del tracto respiratorio superior y una infección latente en ganglios trigéminos. A la observación histopatológica de tejidos traqueales obtenidos de pollos infectados son evidentes la hiperemia, el edema de la mucosa y la numerosa infiltración leucocitaria.

Nuevos genotipos en Australia

El sistema de genotipificación utilizando técnicas moleculares (reacción en cadena de la polimerasa en combinación con análisis de fragmentos de restricción de longitud polimórfica [PCR–RFLP]) se desarrolló en Australia en el 2006. A través de este sistema, se analizaron los patrones de restricción de numerosos genes virales que permitieron distinguir unas cepas de otras y tener una clasificación de genotipos presentes en campo en Australia. Usando este sistema de clasificación genética se empezaron a identificar nuevos genotipos dentro de las cepas virales que se mandaban al laboratorio de la Universidad de Melbourne. En Australia siempre se ha vivido con dos vacunas de origen nacional que se atenuaron y produjeron en dicho país. Cuando hubo escasez de vacunas se decidió importar una vacuna europea que correspondió a la clase 7, al poco tiempo aparecieron brotes de la enfermedad causados por las clases 8 y 9.

En ese contexto, la primera hipótesis era que las clases 8 y 9 eran subtipos virales dentro de la vacuna, que era algo que ya había probado antes en Estados Unidos la Dra. Maricarmen García. Por lo tanto, empezamos a hacer pasajes in vivo de este virus de vacuna para ver si podíamos identificar o aislar virus con distintos genotipos. En forma simultánea el Dr. Lee comenzó a analizar las secuencias de genoma completo de VLTI. Fue así como en 2010 se publicó la primera secuencia de genoma completo de la sepa Serva, una cepa vacunal altamente atenuada de origen europeo y de uso internacional. Luego se secuenciaron los genomas completos de las vacunas australianas tradicionales SA2 y A20. Estas vacunas tiene diferencias en sus grados de atenuación, y por lo tanto el análisis comparativo del genoma completo de ambas permitió identificar potenciales marcadores de virulencia. En el año 2012, se secuenciaron las clases 8 y 9, donde se detectó que había ocurrido una recombinación entre la vacuna europea y las vacunas australianas que estaban en uso en ese momento. Esa fue la primera vez que se identificó la recombinación de virus de cepas vacunales en condiciones de campo.

Se ha planteado la hipótesis que las vacuna de origen europeo y australiano convergieron en tiempo y espacio lo que dio cabida a la generación de recombinantes, ya que la única manera de que se produzca la recombinación del material genético de virus herpes es en el interior del núcleo de una célula infectada, que es el compartimento intracelular donde replica el virus y donde se replica el material genético viral. Las nuevas cepas recombinantes de VLTI causaron numerosos brotes de la enfermedad y por consiguiente importantes pérdidas económicas al a industria avícola local. Recientemente se ha identificado una nueva cepa recombinante y la caracterización de su genoma completo está en curso. En conclusión el sistema de genotipificación en uso en Australia ha sido una muy útil herramienta diagnóstica para identificar las cepas circulantes y determinar la emergencia de cepas nuevas, lo que ha contribuido a la aplicación de mejores estrategias de control de la enfermedad, basadas en el análisis epidemiológico de la información disponible.

¿Evolución hacia cepas virales más virulentas?

Recientemente se ha postulado que hay una evolución hacia cepas virales más virulentas del VLTI. La cepa prevalente en Australia tradicionalmente (clase 2) fue desplazada por las nuevas cepas recombinantes. Para entender la génesis de este fenómeno se hicieron estudios in vivo e in vitro. Los estudios in vitro determinaron que el virus recombinante (clase 9) replicaba más eficientemente en cultivos celulares y en huevos embrionados que la cepa tradicional (clase 2). Por su parte, los estudios in vivo también indicaron que la cepa recombinante replicaba más eficientemente en el tracto respiratorio de pollos infectados, pero además causó más mortalidad, mayor severidad de signos clínicos y de los hallazgos histopatológicos. Asimismo, la cepa recombinante se transmitió más eficientemente que la cepa tradicional desde pollos inoculados a pollos centinela. Estos resultados ayudan a entender las causas del desplazamiento de la cepa tradicional en favor de la nueva cepa recombinante. La hipótesis que estamos manejando actualmente es que probablemente estemos frente a un progresivo aumento de virulencia de cepas de desafío, que es lo que se ha descrito para la enfermedad de Marek.

En Sudamérica (Brasil - Perú)

En Sudamérica se ha hecho algo parecido. El grupo del Dr. Ferreira de la Universidad de São Paulo ha hecho esto mismo una vez que empezaron a tener brotes en Brasil. Dentro de los estudios que realizó el Dr. Chacón -que era alumno del Dr. Ferreira- se incluyó una cepa peruana en estos análisis. La mayor parte de los brotes identificados en Brasil estaban en un grupo filogenético distinto. Después del inicio de los brotes que ocurrieron en Sudamérica desde el año 2008 la industria avícola brasileña comenzó a usar vacunas vivas atenuadas para el control de la enfermedad, mientras que en Perú se eligió utilizar vacunas recombinantes vectorizadas.

Seguridad de vacunas y futuros desafíos

Dentro de los requisitos de la Farmacopea Europea (EP) y la Farmacopea de Estados Unidos (USP) para las vacunas atenuadas para el control de la laringotraqueítis infecciosa, se indica que (i) la vacuna sea de baja virulencia respiratoria, (ii) que no haya aumento de virulencia luego de pasajes in vivo (x 5 veces) y (iii) que debe generar una respuesta inmune medible. Desafortunadamente, hay parámetros importantes en la seguridad de vacunas contra LTI que no son considerados, como por ejemplo la cantidad de virus que un ave vacunada puede eliminar después de un desafío virulento. Otros aspectos importantes en la seguridad de vacunas contra VLTI son las características de transmisibilidad de las vacunas y de la capacidad de la vacuna de prevenir la transmisión de cepas de desafío en aves vacunadas.

Asimismo, la capacidad de cepas vacunales de VLTI de generar infecciones latentes ha sido documentada, pero no sabemos aún si la vacunación previene infecciones latentes por virus de desafío. Una ventaja evidente de las vacunas virales vectorizadas es que éstas no producen infecciones latentes de VLTI, pero tampoco sabemos si generan una respuesta inmune capaz de limitar las infecciones latentes por cepas de campo. Otro aspecto importante en seguridad de vacunas es poder prevenir la recombinación viral en aves. Finalmente, una evaluación del impacto económico de las medias de control establecidas sería una medida objetiva para evaluar la eficiencia de un plan de control.

Un problema adicional en las estrategias de control de esta enfermedad es la carencia de sistemas de monitoreo adecuado de la protección real otorgada por las vacunas. Son de uso habitual las pruebas serológicas tipo ELISA o de sero-neutralización viral por su bajo costo y fácil implementación, pero su utilidad práctica es limitada, debido a que los títulos de anticuerpos detectados no están necesariamente correlacionados con protección. Sabemos que los anticuerpos no protegen contra el desafío y eso ha sido probado en pollos bursectomizados, con transferencia pasiva de anticuerpos y altos niveles de anticuerpo materno que no brindaron protección. Por otro lado, la inmunidad celular es más importante; por ejemplo, los pollos timectomizados no son capaces de resistir a un desafío, y se ha visto además que en transferencia de esplenocitos (posiblemente mediada por células asesinas por naturaleza [“natural killer”, NK]) confieren cierto grado de protección contra el desafío, lo que sugiere la importancia del mecanismo inmune innato en resistencia al desafío. Donde sí son útiles las pruebas de medición de títulos de anticuerpos en suero es en estrategias de control basados en la diferenciación entre vacunados e infectados (DIVA). En este sentido las vacunas virales vectorizadas pueden jugar un papel importante en estrategias de erradicación. Como alternativa a las pruebas serológicas están las pruebas que miden respuesta inmune celular, que si están correlacionadas con protección, pero que, a diferencia de las pruebas serológicas, son muy complicadas y caras de implementar. Ensayos de inmunoproliferación o de medición de interferón gamma a través de ELISA o ELISPOT se han utilizado tradicionalmente para este fin. El desafío actual está en encontrar metodologías más efectivas, eficientes, baratas, fáciles, masivas y convenientes.

Estrategias virales de inmuno-modulación

Los virus herpes en general, son virus complejos que han co-evolucionado con las especies infectadas por millones de años, lo que ha resultado en una variedad de mecanismos de ataque y contra-ataque desarrollado tanto por los hospederos como por los virus. Habitualmente las estrategias virales de sobrevivencia están relacionadas con la modulación del sistema inmune del hospedero. Como ejemplo, el virus de la enfermedad de Marek (Gallid herpesvirus 2) expresa una proteína que cumple funciones biológicas similares a las de la qumioquina CXCL13, mientras que el VLTI (Gallid herpesvirus 1) expresa glicoproteína G, una molécula que se une a una amplia gama de quimioquinas e inhibe sus funciones biológicas. Las quimioquinas son pequeños péptidos secretados por diversos tipos celulares que tienen la función de regular el tráfico de otras células, incluyendo leukocytos, y dirirgirlos, por ejemplo a sitios de infección. Las proteínas virales que mitan o inhiben la función de estas quimioquinas, por lo tanto, tienen la capacidad de modificar las respuestas inmunes inducidas en su contra para su propio beneficio.

La glicoproteína G es una estrategia de inmunomodulación muy conservada entre los Alphaherpesvirinae. En el VLTI es una glicoproteína secretada al medio extracelular que ha sido descrita como un factor de virulencia, ya que virus que carecen de esta proteína tienen un fenotipo atenuado in vivo y por lo tanto han sido propuestos como candidatos a vacuna. Esta proteína viral ligante de quimioquinas de amplio espectro (vCKPB); tiene funciones  inmunomoduladoras. Estudios in vivo e in vitro que han comparado las respuestas inmunológicas entre infecciones con virus que expresan la glicoproteína G con virus que no la expresa ha permitido establecer un modelo que explica sus funciones biológicas.

Al infectarse una célula epitelial por el VLTI, se inicia una cascada de señales intracelulares, gatilladas por la detección de las moléculas virales en distintos compartimentos intracelulares que culminan en la expresión y secreción de quimioquinas y citokinas y la activación de señales inflamatorias. El virus replica en el núcleo celular, donde la nueva progenie viral es producida y como parte de este proceso se expresa la glicoproteína G, que en el caso de VLTI, es secretada al medio extracelular. La expresión y secreción de esta glicoproteína se traduce en cambios en la cantidad de leucocitos reclutados en el sitio de la infección, especialmente células T CD4 y CD8, y heterófilos, mediados por la inhibición de lafunción quimiotáctica de las quimioquinas.

Entre los próximos desafíos en investigación de respuesta inmune contra VLTI se encuentran comprender  mejor el rol de los leucocitos (especialmente células NK en la eliminación de la infección); asociaciones entre respuesta inmune, factores de virulencia y manifestación clínica; determinante de virulencia y respuesta inmune; e importancia de las interacciones con atógenos respiratorios.

En conclusión, la vacuna ideal contra LTI, debiere ser conveniente, fácil y barata de aplicar uniformemente. Debiere además replicar por un corto periodo en el tracto respiratorio de las aves, lo que limitaría las posibilidades de transmisión a aves susceptibles. Idealmente no causaría signos clínicos ni disminuciones en los parámetros productivos y prevendría la replicación y  transmisión de cepas de desafío. Adicionalmente esta vacuna debería prevenir la infección latente por cepas desafío y permitir estrategias de control y erradicación basadas en la diferenciación entre aves vacunadas e infectadas (DIVA).

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