Actualidad Avipecuaria Avibacterium Paragallinarum: Serogrupos prevalentes en el Perú
viernes, 17 agosto del 2018

1Alfredo Mendoza Espinoza, 1Silvia Ascanio, 1Melanie Caballero, 1Rober Rojas, 2Rosa I. Delgado y 3Yosef D. Huberman

1Laboratorio de Investigación y Desarrollo, Unidad de Negocio Feed - Quimtia S.A., Perú.

2Médico Veterinario - Práctica privada.

3Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Estación Experimental Agropecuaria (EEA) Balarce, Argentina.



Avibacterium Paragallinarum: Serogrupos prevalentes en el Perú

Avibacterium Paragallinarum: Serogrupos prevalentes en el Perú
Mayo 15/2018
Lima - Perú
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Introducción

Avibacterium paragallinarum es el agente etiológico de la coriza infecciosa, una enfermedad del tracto respiratorio alto de las aves (Gallus gallus) (1,2,3,4). La enfermedad afecta a gallinas ponedoras, aves reproductoras y pollos de engorde. El control de la coriza infecciosa se basa principalmente en el uso de vacunas inactivadas. En áreas donde la enfermedad prevalece, es recomendable combinar la vacunación con la administración de desinfectantes para reducir la exposición ambiental. Se ha demostrado que tal procedimiento reduce efectivamente los signos clínicos de la enfermedad (5).

Av. paragallinarum es una bacteria Gram-negativa pleomórfica que requiere de NAD (nicotín-adenín-dinucleótido) para el crecimiento in vitro (4), aunque en México (6) y Sudáfrica (7) se han reportado cepas NAD independientes. La independencia de NAD puede deberse a la transmisión de un plásmido (8). La identificación se realiza mediante pruebas bacteriológicas y Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (4,19).

El esquema de clasificación serológica más utilizado para Av. paragallinarum es el esquema de Page (9). Usando este esquema, el total de tres diferentes serovares, denominadas A, B, y C, son reconocidos. Posteriormente, mediante las pruebas de inhibición de la hemaglutinación, Kume et al. (6) describe siete serovares (HA-1 a HA-7), distribuidos en tres serogrupos (denominados I, II, y III), en el esquema conocido como esquema de Kume. Blackall et al. (10) reconoció las conexiones entre estos 2 esquemas y describe un nuevo esquema que consiste en nueve serovares agrupados en tres serogrupos: serogrupo A que consiste en 4 serovares (A1, A2, A3 y A4), serogrupo B un serovar (B1), y el serogrupo C que tiene 4 serovares (C1, C2, C3 y C4). Este esquema combinado es muy útil y flexible porque permite la incorporación de nuevos serovares (11).

El objetivo de este estudio fue conocer los serovares de Av. paragallinarum circulantes en Perú provenientes de gallinas ponedoras, reproductoras y pollos de engorde.

Materiales y métodos

Bacterias. Un total de 20 aislamientos de Av. paragallinarum provenientes de gallinas ponedoras, pollos de engorde y reproductoras enfermas fueron examinadas (Tabla 1). Todos los aislamientos se obtuvieron durante 1998 al 2016 a partir de casos clínicos típicos de Coriza Infecciosa; las muestras fueron aisladas del seno infraorbitario. Cepas de referencia de Av. paragallinarum 0083 (serovar A), 0222 (serovar B) y Modesto (serovar C) fueron proporcionados amablemente por Animal Research Institute, Yeerongpilly, Australia (12). Las cepas de Av. paragallinarum H23 (serovar A), H8 (variante serovar B) (13) y H32 (serovar C) se obtuvieron a partir de brotes de Coriza Infecciosa en Argentina (5,14,15). El aislamiento y serotipificación se llevaron a cabo en los laboratorios de Investigación y Desarrollo de Quimtia S.A. y en el Laboratorio de Bacteriología del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) EEA Balcarce, respectivamente.

Medios de cultivo y pruebas de caracterización. Agar Sangre Columbia, suplementado con 7% de sangre equina hemolizada (ASEH) (3,16) y caldo TM/SN suplementado con 25 μg/mL de NADH, suero de pollo inactivado al 1% y 5% complejo oleico-albúmina (10), se usaron para la preparación de antígenos. Todas las cepas se caracterizaron bioquímicamente de acuerdo con Terzolo et al. (16).

Antisuero: Los antisueros de conejo se realizaron de acuerdo con Thornton y Blackall (17) contra cepas de referencia de Av. paragallinarum 0083, 0222 y Modesto (12) y las cepas argentinas H23, H8 y H32 (14,15).

Preparación de antígenos para pruebas de serotipado. Las cepas de Av. paragallinarum se cultivaron en microaerofilia en placas ASEH (4), que se usaron para sembrar 600 mL de caldo TM/SN suplementado. Después de la incubación, el caldo se centrifugó dos veces a 4800 x g durante 15 minutos a 4 °C. El sedimento se suspendió en 1 mL de PBS más timerosal (100 μg / ml) y se centrifugó de nuevo a 5000 x g durante 2 minutos a 4 °C. El sedimento se volvió a suspender en 4 mL de PBS más timerosal y se mantuvo a 4 °C hasta su uso.

Pruebas de hemaglutinación. Todos los aislados fueron serotipificados de acuerdo con el esquema de Page (9) modificado por Blackall et al. (11), siguiendo la prueba de inhibición de la hemaglutinación de Eaves et al. (18) Brevemente, se realizaron diluciones en serie de 2 veces de 50 μL en WB de cada antígeno. A cada dilución, se añadieron 50 μL de eritrocitos y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente.

Pruebas de inhibición de la hemaglutinación. Se prepararon diluciones en serie de 2 veces en 50 μL de WB para cada antisuero. A cada dilución, se añadieron 50 μL de cuatro unidades de hemaglutinación (18) del antígeno correspondiente. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, se añadieron 50 μL de eritrocitos.

Después de otros 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, se determinó el serovar de cada cepa como el título más alto de inhibición de la hemaglutinación. Todos los aislamientos que no pudieron ser serotipificados mediante el uso de los sueros producidos contra las cepas de referencia 0083, 0222 y Modesto se volvieron a analizar utilizando los sueros producidos contra las cepas argentinas H23, H8 y H32.

Resultados y discusión

Mediante pruebas bioquímicas y moleculares (16,19) se identificaron los 20 aislamientos como Av. paragallinarum, de los cuales 19 fueron NAD dependientes y 1 sólo NAD independiente. El origen de cada aislamiento, tipo de producción y fechas de aislamiento se describen en la Tabla 1.

Once de los veinte aislamientos se han encontrado en la provincia de Lima, donde se encuentra la mayoría de la producción avícola peruana y donde se reconocieron la presencia de tres serovares. Los otros 9 aislamientos se obtuvieron de otras cinco provincias (Tabla 1). Los serovares de la variante B se encontraron en las provincias de Arequipa, Ica y La Libertad. De acuerdo con el esquema de Page (9), modificado por Blackall et al. (11), utilizando el antisuero de conejo producido contra las cepas de referencia 0083 (serovar A), 0222 (serovar B) y Modesto (serovar C), se estableció que seis aislamientos se clasificaron como serovar A, seis aislamientos como serovar B y cinco aislamientos se clasificaron como serovar C; cuatro aislamientos (aislados 1, 2, 4 y 5) no pudieron ser serotipificados (Tabla 1). Sin embargo, usando el antisuero de conejo contra las cepas argentinas H23 (serovar A), H8 (variante serovar B) y H32 (serovar C), permitió la asignación de estos aislados no clasificados 1, 2, 4 y 5 como pertenecientes a la variante serovar B. Era poco común encontrar cepas del serovar B como causa de brotes de Coriza Infecciosa en todo el mundo hasta que se describieron en Argentina (16) en 1993 como un serotipo prevalente.

Comparando los aislamientos B argentinos antes mencionados por electroforesis enzimática multilocus con 118 cepas de 5 continentes en todo el mundo (13), se encontró que estas cepas se asignaron en un grupo separado y eran diferentes de las otras cepas, incluidos los otros aislados del serotipo B. La cepa H8, que se usó en este trabajo para producir antisuero, fue una de estas cepas. En la actualidad, se han descrito cepas variantes B en Argentina, Ecuador, Estados Unidos y Zimbawe (14).

Hasta ahora, todas las variantes de cepas B han sido serotipificadas usando antisueros internacionales de referencia B (16). En este estudio, las cuatro cepas B variantes del Perú no pudieron ser serotipificadas usando el antisuero estándar B, mientras que podrían asignarse como el serovar B utilizando el antisuero producido contra un aislado argentino de la variante B. Estos resultados sugieren que estos aislados peruanos podrían estar menos relacionados con la cepa B de referencia que con la variante B argentina. En pruebas de desafío dirigidas a evaluar la protección brindada por diferentes vacunas comerciales y experimentales, se ha demostrado que había una protección cruzada limitada entre las cepas estándar y variantes del serogrupo B (15). Por lo tanto, para poder brindar protección, es de gran importancia detectar la presencia de cepas variantes B en un área geográfica determinada y, en consecuencia, las vacunas inactivadas que se utilizarán en el Perú deberían incluir los tres serogrupos reconocidos (A, B y C) junto con las cepas de la variante B peruana.

Al mismo tiempo, se deben realizar más estudios, particularmente ensayos de protección cruzada, para determinar si estas diferencias serológicas realmente representan diferencias que son significativas en términos de protección de la vacuna.

Cepa de Av. paragallinarum NAD independiente del serovar C ha sido reportada en pollos de carne de Arequipa (20) mientras que la cepa en el presente trabajo fue aislada de gallinas ponedoras de Trujillo. Cepas similares han sido reportadas anteriormente en México (21,22), China (23) y Sudáfrica (24). Se menciona que la independencia de NAD está asociada a un plásmido (21); en el presente estudio se desconoce sí el aislamiento contiene uno de ellos. Soriano et al. 2012, refieren que las cepas variantes independientes de NAD son menos virulentas que las variedades típicas dependientes de NAD (21); por otro lado Bragg Para brindar protección es de gran importancia detectar la presencia de cepas variantes B en un área geográfica determinada y, en consecuencia, las vacunas inactivadas que se utilizarán en el Perú deberían incluir los tres serogrupos reconocidos (A, B y C) junto con las cepas de la variante B peruana. et al. (8) menciona que la protección cruzada es parcial con aislados NAD independiente. Por tanto, un próximo estudio de patogenicidad y protección cruzada debería confirmar la inmunogenicidad de dicha cepa y la necesidad de su inclusión como antígeno vacunal.

Bibliografía

Para solicitar la bibliografía del presente artículo escribir a: melanie.caballero@quimtia.com

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